SN/T 3963-2014 桃丛簇花叶病毒检测方法

SN/T 3963-2014.Detection of Peach rosette mosaic virus. 1范围 SN/T 3963规定了桃丛簇花叶病毒的检疫鉴定方法。 SN/T 3963适用于桃树、葡萄等植物材料中桃丛簇花叶病毒的检疫和鉴定。 2原理 桃丛簇花叶病毒学名: Peach rosette mosaic virus ,缩写:PRMV。该病毒外壳蛋白的特异性及其基因组核酸序列的特殊性是本标准制定的主要依据。相关资料参见附录A。 3仪器设备、用具及试剂 3.1仪器设备 酶标检测仪、实时荧光PCR仪、低温冰箱、恒温箱、高压灭菌锅、电子分析天平、台式高速冷冻离心 机、恒温水浴锅、制冰机等。 3.2 用具 微量可调移液器(量程分别为25μL、10μL、100μL、200μL和1mL)及灭菌的吸头、1.5 mL离心管、研钵、酶联板、0.2 mL PCR管、96孔PCR反应板及盖子等。 3.3试剂 主要试剂、缓冲液、引物和探针序列等见附录B和附录C。 4检测与鉴定 4.1血清学(双抗体夹心酶联免疫吸附测定) 4.1.1包被抗体 将PRMV的抗体用包被缓冲液稀释至工作浓度,加入酶联板中,每孔加入100 μL。将酶联板加盖(或用保鲜膜密封后)放入保湿盒中,置于37 °C恒温箱中温育2 h(或4℃冰箱过夜)。之后每孔加入300μL PBST洗板3次,每次3 min。 4.1.2样品制备 称取待检植物叶片0.2g,加入2mL样品抽提缓冲液，充分研磨后，转入1.5 mL的离心管中，5000r/min离心5min,取上清液,即为1:10稀释的样品粗提液。