SN/T 2627—2010 马铃薯卷叶病毒检疫鉴定方法

SN/T 2627—2010. 1范围 SN/T 2627规定了进境植物检疫中马铃薯卷叶病毒检衡鉴定的程序。 SN/T 2627适用于马铃薯块茎、种苗等茄科植物感染马铃薯卷叶病毒的检验和鉴定。 原理 马铃薯卷叶病毒( potato leafrbll_virus.PLRy)。属马铃薯黄症病毒科,马铃薯卷叶病毒属。病毒粒体球状,粒体直径23 nm~25 nm,是等轴对称病悉，致死温度℃,稀释限点约10~‘。引起马铃薯卷叶病毒病。马铃薯病毒病一般根据病害症状很难确定病啬种类,采用免疫学和分子生物学方法,可快速根据有关判断标准进行马铃薯卷叶病都桧疫鉴定。 3试剂与材料 除非另有说明,在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和燕馏水或去离子水或相当纯度的水。.3.1免疫学检验试剂 3.1.1捕捉抗体(Capture antiboy)马铃薯卷呼病毒免疫球蛋白抗体稀释度按市售产品要求进行。储藏于4℃条件下备用。 3.1.2酶标抗体(Alkaline phogphatasogenzyrge conjugate);阀碱性磷酸酶标记的马铃薯卷叶病毒的免疫球蛋白抗体。按巿售产品要*进行稀释,储于4℃条件下备用。 3.1.3包被缓冲液(Coating bhffer) :取2.9多g碳酸氢钠(NAco,8,1.59 g碳酸钠(NaCO ),0.2 g叠氮化钠(NaN),用1 000 ml蒸馏水溶娜,并调p值到.6.储拳于4℃条件下备用。 3.1.4洗涤液(PBST Buffer);取1.15 g无水磷酸敌二销(NaHPy.>),0.2 g氯化钾(KCI),0.2 g无水磷酸二氢钾(KHPO,)、8.0 g氡化的(.NaCl),0.5g吐温-本,用1 g0 ml.蒸馏水溶解,并调整pH值到7.4。 3.1.5样品提取液(GEB buffer):取 1.3 g无水硫酸钠(NagSO, )、20.0 g 聚乙烯毗咯烷酮[(C。H,NO)x~nooo],0.2g叠氮化钠(NaN ),2.0 gⅡ级鸡蛋清白蛋白粉、20.0 g 吐温-20,用1 000 mL洗涤液溶解﹐并调整pH值到?.4,储藏于4℃条件下备用。 3.1.6﹑酶标抗体稀释缓冲液(ECI Buffer):取0.2 g牛血消白蛋白(或脱脂奶粉)、2.0 g聚乙烯吡咯烷酮[(CH,NO),].0.02g叠氮化钠(NaN ),用100 ml,洗涤缓冲液溶解,并调整pH值到7.4,储藏于4 ℃条件下备用。 3.1.7︰底物级冲液(PNP Buffer):用:80 mL灭菌蒸馏水将0.01 g氯化镁(MgCl),0.02 g叠氮化钠(NaN,)、9.7 ml二己醇胺(CH,CH,OH)溶解后,用盐酸调pH值到9.8,定容到100 mL,储藏于4 ℃条件下备用。 3.1.8底物溶液(PNP substate):将5 mg对硝基苯磷酸盐(C。H,NO,)溶解于5 mL底物缓冲液中。