SN/T 1418—2004 鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和试验

SN/T 1418—2004. 1范围 SN/T 1418规定了鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒血清中和试验操作方法。 SN/T 1418适用于检测血清中的鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒抗体。主要用于鸭病毒性肝炎的诊断及病原鉴定、免疫水平的监测和流行病学调查。 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2.1 BME:Eagle's Basal Medium 细胞基础盐培养基。 2.2 CPE:细胞病变。 2.3 DEK:鸭胚肾细胞。 2.4 DEL:鸭胚肝细胞。 2.5 DHV-Ⅰ :鸭病毒性肝炎Ⅰ型病毒。 2.6 FCS:胎牛血清。 2.7 MEM;Eagle’s Minimal Essential Medium细胞培养基。 2.8 PFU;空斑形成单位。 6血清中和空斑减数试验 6.1病毒毒价测定及配备 取DHV-Ⅰ用维持液将病毒液作10倍系列稀释,每个稀释度接种三个培养皿,按7.2.4和7.2.5的方法进行试验。取每个稀释度的三个培养皿的空斑平均数,用Reed-Muench法计算病毒的PFU量，使用前配制成含200 PFU/0.1 mL的病毒悬液备用。 6.2操作步骤 6.2.1血清稀释及中和感作:分别取阳性血清、阴性血清.受检血清样品,用维持液作两倍系列稀释,每个稀释度加入等量病毒悬液,然后置37℃中和感作60 min,每个稀释度接种三个培养皿。 6.2.2细胞对照:设三个培养皿的正常细胞对照,加入维持液。 6.2.3病毒对照:设三个培养皿的病毒对照,将上述使用的病毒悬液稀释为100 PFU/0.1 mL。 6.2.4︰取已长满DEL细胞单层的细胞培养皿,吸去培养液,用维持液清洗两次,将上述稀释及感作好的混合液移人细胞培养皿内,每个培养皿0.1 mL,加盖后轻轻摇,使液体均匀分布于DEL细胞单层表面,然后置室温(20℃~22℃)感作30 min。 6.2.5每培养皿加人琼脂维持液3 mL,加盖后,置37℃、3%～~5%二氧化碳培养箱培养48 h,取出后用偏光源(或低倍倒置显微镜)直接观察空斑的形成情况,或用10%的福尔马林固定后用1%的结晶紫染色观察空斑,并记录形成空斑的数量。 6.3 结果判定 6.3.1当细胞对照正常,阳性血清效价与原滴定的效价相差1个滴度以内,病毒对照的三个培养皿的平均空斑数误差在10 PFU以内时整个试验有效。 6.3.2出现50%空斑减数的血清最高稀释倍数为该血清的抗体滴度。