SN/T 1454-2004 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法

SN/T 1454-2004. 1范围 SN/T 1454规定了鸡马立克氏病病毒(MDV)的分离鉴定方法。本标准适用于鸡马立克氏病(MD)流行病学调查和口岸检疫。 2材料准备 2.1一日龄 MD敏感鸡;用SPF种蛋孵化。 2.2鸭胚成纤维细胞(DEF)的制备:见附录A。 2.3鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备;同2.2。 2.4细胞培养液的制备;见附录B。 2.5淋巴细胞分层液。 2.6标准的MDV分型单克隆抗体。 2.7缓冲溶液配制: 磷酸盐缓冲液(PBS); 含0.05%吐温-20的PES。以上溶液配制方法见附录B。 2.8标准MDV;MDV Ⅰ型病毒GA毒株。 3采样 挑选临床发病的MD疑似病鸡,无菌采集枸橼酸钠抗凝全血5 mL/鸡~10 mL/鸡,加入淋巴细胞分层液，200 g离心5 min,分离收集淋巴细胞,并用无菌PBS洗涤两次,用细胞维持液稀释成10’个/mL淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加入15%的二甲基亚矾后保存在液氮(一196℃)中备用。 4操作方法 4.1接种和培养 取生长良好的 DEF单层,弃去维持液,接种0.2 mL处理好的淋巴细胞悬浮液,置含5%二氧化碳的培养箱,37℃下吸附1.5 h。补充适量维持液继续培养,24 h内换液一次,以后每2d~3 d换液一次。在培养过程中每日观察细胞病变(CPE)产生情况,同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。 4.2收集 在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下,将产生广泛CPE(蚀斑形成面积占30%以上)的DEF单层培养瓶中的维持液弃去,用0.01%胰酶消化,加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用,或者加二甲基亚孤后置液氮(一196℃)中保存备用。 4.3克隆 将收集的具有广泛CPE的细胞悬浮液进行稀释,接种于96孔细胞培养板,使每孔平均含有1个细胞,继续培养至孔内产生CPE。选择只有单个病灶的孔,吹打下孔壁细胞,移入细胞培养瓶扩大培养。同法重复克隆二至三次。所收集的培养物就是供鉴定用的MDV分离物。