SN/T 1476-2004 鲑鱼肾杆菌聚合酶链式反应操作规程

SN/T 1476-2004. 1范围 SN/T 1476规定了用聚合酶链式反应技术检测鲑鱼肾杆菌的方法。本标准适用于鲑鱼肾杆菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注H期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3试剂和材料 3.1Taq酶 -20℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。 3.2dNTP 含dCTP,dGTP,dATP,dTTP各 10 mnol/L。 3.3 引物 一-对引物,浓度为40 umol/L,序列为: 5-CAA GGT GAA GGG AAT TCT TCC ACT-35'-GAC GGC AAT GTC CGT TCC cGG TTT-3' 扩增鲑鱼肾杆菌中p57蛋白的5o1个碱基的DNA片断。 3.4无水乙醇 分析纯,使用前预冷到一20℃.3.5矿物油 5.2制样 在1.5 mL的Eppendorf离心管中加入25 mg~100 mg组织或200 uL体腔液﹐先加入150 pLCTAB溶液(见附录第A.1章),剪碎、研磨,再用搅拌器将样品勾浆成糊状。加CTAB.到 900 pL。摇匀后,25℃作用2.5 h。 6鲑鱼肾杆菌核酸的鉴定 6.1DNA抽提 加600 uL酚-三氯甲烷-异戊醇(见第A.3章),充分混合30 s;12 000 r/min离心5 min,取上层水相;加700 uL三氯甲烷-异戊醇(见第A.2章),用力混合30 s;12 000 r/ min离心5 min,取上层水相;加1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇,混勾后~20℃过夜以沉淀核酸(在不能及时进行PCR检测的情况下,可置于1.5倍体积无水乙醇中,长期保存);15 000 r/min离心 30 min,小心弃上清,立即用滤纸吸干(应尽量充分吸干),37℃干燥约20 min;加 10 pL水溶解后,作为PCR模板。 6.2PCR扩增 PCR反应混合物总体积100 pL。含10 uLTaq酶用10倍缓冲液(见第A.7章)、10 pL, 25mmol/L氯化镁(MgCl)(见第A.6章)、2 pL dNTP(各200 umol/L)、引物各2.5 uL(100 pmol/L), 1 pL Taq酶(5IU/uL)和62 uL水,然后加入10 uL待测样品DNA作为模板。最后在反应混合物上覆加50 pL矿物油。 混匀后稍离心,让矿物油在上层。再将反应管置于PCR扩增仪。先94℃热变性4 min,然后94℃1 min--48℃ 1 min→72℃ 2 min 30次循环，再72℃ 10 min,最后t℃保温。