SN/T 1166-2010 水泡性口炎检疫技术规范

SN/T 1166-2010. 1范围 SN/T 1166规定了动物水泡性口炎的病毒分离及鉴定,反转录聚合酶链反应、荧光反转录聚合酶链反应、中和试验﹑竞争酶联免疫吸附试验的技术要求。 SN/T 1166适用于动物水泡性口炎的检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是在日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包插所有的修改单造用于本文件。 GB/T 18088出入境动物检疫采样 3缩略语 以下缩略语适用于本文件。BHK-21 :仓鼠肾细胞 BLP:乳糖蛋白豚缓冲肉汤CPE:致细胞病变作用 Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数c-ELISA:竞争酶联免疫吸附诫验- DEPC:焦碳酸二乙酯 McAb.单克隆抗体OD值:光密度值PI:抑制百分比 TCIDso:半数组织培养感染量vero:非洲绿猴肾细胞 vSV:水泡性口炎病毒 vsV-IND:水泡性口炎病毒印地安那型vSV-NJ:水泡性口炎病毒新泽西型‘ 5.3.1.2被检样品的处理:将采集到的上皮、淋巴结或组织样品,经研磨后用0.01 mol/L pH7.2的PBS配制成`20%的悬液。全血,胚胎及其冲洗液、细胞培养物无需处理;取450 uL样品悬液放人1.5 mL的离心管,再加入450 pL变性液并混匀,旋涡振荡混合20 s,冰浴15 min。 5.3.2对照样品制备和处理 5.3.2.1阳性对照样品制备:将水泡性口炎病毒NJ型和IND型分别接种BHK-21或Vero细胞单层，37℃吸附1 h后加人维持液﹐置5%二氧化碳培养箱37℃培养,逐日观察。待CPE达75%以上,冻融两次,收获细胞培养病毒悬液,分装成1 mL小瓶,置一70℃保存备用。 5.3.2.2阴性对照样品制备:制备BHK-21或Vero细胞单层,弃去细胞培养液,加入维持液,置5%二氧化碳培养箱37℃培养3 d,冻融两次,收获细胞悬液;分装成1 mL小瓶,置一70℃保存备用;或采集相同动物的组织样品作为阴性对照样品。 5.3.2.3对照样品的处理:取450 uL阳性和阴性对照样品细胞悬液放入1.5 mL的离心管﹐再加入450 pL变性液并混匀,旋涡振荡混合20 s,冰浴15 min。 5.3.3 RNA提取 5.3.3.10取250 pL处理后的样品蹬1.5 mL eppendorf管中,作好标记,同时设立阳性样品、阴性样品对照,加人3倍体积Trizol.振荡混合20 s.静置5 min. 5.3.3.2加入200 pL三氯甲烷,振荡混合20 s,静置5 min;4 ℃ 12 o00 r/min离心15 min,取上清液置另一个标记好的1.5 mL eppendorf管中,加入等体积异丙醇，一20 ℃静置15 min。 5.3.3.3 4 ℃ 12 000 r/min离心15 min,轻轻弃上清液,加1 mL DEPC水配制的75%乙醇。 5.3.3.4 4 ℃ 12 000 r/min离心15 mi,小心弃去乙醇,倒置滤纸上,烘干,加20 uL DEPC水溶解,立即进行cDNA的合成或一80℃保存备用。 5.3.3.5 RNA提取也可采用等效的商品化病毒RNA提取试剂盒制备RNA。