SN/T 1182.2—2004 禽流感微量红细胞凝集抑制试验

SN/T 1182.2—2004. 1范围 SN/T 1182.2规定了用微量红细胞凝集抑制试验检测禽流感抗体的试验方法。本标准适用于禽类禽流感检疫﹑疫情监测和流行病学调查。 2试剂和材料 2.1试剂纯度 所有化学试剂均为分析纯。 2.2pH7.2,0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法见附录A。 2.3 红细胞泥 配制方法见附录A。 2.41%鸡红细胞悬浮液 将鸡红细胞泥用PBS稀释成1%悬浮液。 2.5标准抗原 禽流感H5、H7、H9等标准抗原。 2.6标准血清 禽流感H5,H7、H9等标准阳性血清和标准阴性血清。 2.7被检血清 2.7.1无菌采取动物血液,凝固后离心分离血清,置于4℃或-20℃保存备用。 2.7.2除鸡外其余禽的血清需先确定是否存在非特异性凝集。有特异性凝集的,血清按下列方法进行处理:每0.5 mL血清加25 pL鸡红细胞泥,轻轻振荡﹐静置30 min,2 000 r/min离心2 min~5 min,红细胞沉聚,取出吸附过的血清供检。 2.8 器材 架盘天平、分析天平﹑离心机、V型微量血凝板﹑微型振荡器、可调移液器,恒温箱等。 3.1.1在V型微量血凝板上,每孔加入PBS 25 pL。' 3.1.2孔1加禽流感标准抗原25 pL,反复吹打充分混匀,移出25 pL至孔2;吹打混勾,移出25 pL至孔3,依次类推作等量倍比稀释至孔11,孔11弃去 25 puL。孔12不加抗原设立为红细胞对照。 3.1.3 每孔加人PBS 25 pL。 3.1.4每孔加入1%鸡红细胞悬浮液25 pL,立.即置微型振荡器上振荡或手持血凝板绕圆圈混匀。 3.1.5室温(约20℃)下静置40 min左右;如果室温太高,可在4℃静置约60 min。对照红细胞呈明显的圆点状时进行抗原效价判定。完全血凝的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价,即一个血凝单位(HAU)。 3.1.6 4 HAU抗原的标定 3.1.6.1根据3.1.5测定的抗原的血凝效价,计算4HAU抗原的稀释倍数。例如表1抗原效价为2'(1 ∶128),其4个单位抗原效价为25(1 : 32),则将抗原稀释32倍。 3.1.6.2将25 puL含4 HAU的抗原用PBS做等量倍比稀释,使每孔(25 uL)含有2HAU,1 HAU,0.5 HAU,0.25 HAU,每孔补加PBS 25 pL,再加入1%鸡红细胞25uL,判定血凝图像与预期结果是否相符。2 HAU,1 HAU孔红细胞应出现完全凝集,0.5 HAU孔红细胞应出现50%凝集,0.25 HAU孔红细胞应不凝集。若与此不符,应重新配制抗原,测定效价。 3.2微量血凝抑制试验 微量血凝抑制试验见表2。