SN/T 1559.3-2005 非洲猪瘟病毒红血球吸附试验操作规程

SN/T 1559.3-2005. 1范围 SN/T 1559.3规定了红血球吸附试验检测非洲猪瘟病毒的方法。本标准适用于检测组织或外周血中的非洲猪瘟病毒。仪器设备 2.1组织研磨器或捣碎器。 2.2离心机。 2.3二氧化碳培养箱。 2.4恒温培养箱或水浴箱。 2.5显微镜、倒置显微镜。 2.6leigton 管(160 mm× 16 mm). 3试验材料 3.10.9%氯化钠:配制方法参见附录A。 3.2 0.01 mol/L pH7. 4 PBS(磷酸盐缓冲液):配制方法参见附录A。 3.3‘青霉素、链霉素、庆大霉素和制霉菌素。使用前宜用上述PBS分别配成10 000 IU/mL、10 mgmL,500 1U/mL和500 IU/mL的溶液。 3.4肝素:使用前用0.9%氯化钠配成1 000 1U/mL。 3.5细胞基础培养液(如MEM 等);配制方法参见附录A。 3.61%猪红血球;配制方法参见附录A。 3.7非洲猪瘟标准毒株。 3.8被检材料:包括肝素抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检材料应置于尽可能的低温，但不冻结的容器内保存、运送。 4.1.5接种 每份组织悬液接种3管或4孔白细胞培养物,每管接种0.2 mL或每孔接种25 ul。用工作浓度的非洲猪瘟标准毒株接种1管或1孔白细胞培养物,作阳性对照。另留Ⅰ管或1孔白细胞培养物不接种病毒,作阴性对照。 4.1.6加红血球 37℃培养3d后,每管加人0.2 mL或每孔加入25 uL 1%猪红血球,继续培养于37℃。 4.1.7镜检 每天用显微镜或倒置显微镜检查细胞病变和红血球吸附情况,连续检查7 d~10 d. 4.1.8 结果判定 将培养物轻轻摇动后置于低倍镜下(10×)观察。阳性对照的白细胞表面有大量猪红血球附着,形成玫瑰花状或桑甚体状;而阴性对照的白细胞无红血球附着,则对照成立,可进行结果判定。以第10天的检查结果为终判结果。 1管或1孔以上白细胞表面吸附有大量猪红血球的被检材料,判为阳性;否则判为阴性。如为阴性,宜将培养物的上清液再传代或用直接免疫荧光试验检测白细胞沉淀物。