SN/T 1699.2—2006 猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验操作规程

SN/T 1699.2—2006. 1,范围 SN/T 1699的本部分规定了猪流行性腹泻病毒直接免疫荧光试验的操作方法。本部分适用于猪流行性腹泻的诊断。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过SN/T 1699的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。 GB/T 6822分析实验室用水规格和试验用法 3缩略语 下列缩略语适用于SN/T 1699的本部分。 3.1 PED 猪流行性腹泻。 4仪器设备 荧光显微镜,冰冻切片机、眼科镊子,载玻片,盖玻片、染色缸。 5试验材料 5.10.01 mol/L pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS) 6操作方法 6.1标本的制作 将取得的病死猪的空肠样本,放于洁净培养皿中,加入少量PBS液,用眼科剪子剖开肠管在PBS液中轻轻漂洗,除去肠腔内容物,取洁净的肠管为样本。 6.1.1肠上皮细胞洗脱物涂片 取一段洁净样本,放人离心管或反应管,加 3 mL~5 mLPBS液,以细玻璃棒搅拌1 min~3 min,待PBS液混浊后,取出肠管,以1 000 r/min离心沉淀5 min,弃去上清液。用铂耳钩取肠上皮洗脱物，于洁净的载玻片上涂片,每个肠管样本涂两张以上玻片。自然风干后,浸于丙酮缸内,室温条件下固定15 min,取出自然风干,制成肠王皮细胞洗脱物涂片标本。 6.1.2肠组织冰冻切片 另取--段洁净样本,剪成0.2 cm~o.8 cm.长的肠段,立即用眼科镊子将肠段直立在冰冻台上,待肠管冻结后,将肠管切片,贴于洁净的载玻片,风干,浸于丙酮缸内,室温条件下固定15 min,制成肠管切片标本。 6.2染色 按荧光抗体说明书标定的工作效价,用0.2‰伊文思蓝稀释荧光抗体。将稀释后的荧光抗体直接滴加到固定的肠上皮细胞洗脱物涂片标本及肠管切片标本上y以覆盖满为宜。放湿盒中于37℃温箱感作30 min。 6.3漂洗 从温箱中取出后,将染片用.PBS液漂洗三次,每次3.min,随后用蒸馏水浸泡三次,每次3 min。