SN/T 1447.1—2004 猪传染性胸膜肺炎阻断酶联免疫吸附试验

SN/T 1447.1—2004. 1范围 SN/T 1447.1规定了阻断酶联免疫吸附试验检测猪传染性胸膜肺炎型特异性抗体的方法。本标准适用于猪传染性胸膜肺炎的检疫﹑流行病学调查、诊断和免疫监测。 材料 2.1试剂 2.1.1磷酸氢二钠(NazHPO.·12H,O)。 2.1.2磷酸二氢钾(KH,PO,)。 2.1.3氯化钠(NaCI)。 2.1.4柠檬酸(CHRO·H,O)。 2.1.5邻苯二胺(OPD)。 2.1.630%过氧化氢(H:Oz)。 2.1.7硫酸(H, SOx)。 2.1.8 吐温-20(Tween-20)。 2.1.9 牛血清白蛋白(BSA)。 2.1.10包被液﹑稀释液﹑洗液﹑酶底物溶液和终止液的配制见附录A。 注:所有化学试剂均为分析纯。 2.2仪器设备 2.2.196孔酶标板。 2.2.2多通道、单通道可调移液器及加样头。 2.2.3 玻璃试管。 4操作方法 4.1包被抗原 将猪传染性胸膜肺炎抗原用包被液稀释成工作浓度,包被酶标板,每孔100 pL,加盖后放置4℃冰箱过夜。 4.2封闭 次日取出酶标板,置37℃恒温箱或室温30 min后,弃去包被液,每孔加200 uL稀释液,37℃孵育1 h。 4.3洗板 取出酶标板弃去液体后,每孔加洗液300 uL,洗板,共三次,每次2 min。最后一次倒置拍干。 4.4加样 被检血清用稀释液作1∶4稀释,每份血清加⒉孔,每孔100 pL。设立下列对照:猪抗传染性胸膜肺炎标准阳性血清(阳性对照),标准猪阴性血清(阴性对照),兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清(兔抗APP对照)空白对照。阳性、阴性血清对照同被检血清一样,用稀释液作1∶4稀释,每个对照加2孔,每孔 100 uL。兔抗APP对照和空白对照同样加两孔,每孔加100 pL稀释液,37℃作用l h. 4.5祇加兔抗APP高免血清 用稀释液将兔抗猪传染性胸膜肺炎标准阳性血清稀释成工作浓度﹐每孔100 pLv空白对照每孔加100 puL稀释液,37℃作用30 min。 4.6洗板 按4.3操作。 4.7加猪抗兔lgG━辣根过氧化物酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释成工作浓度,每孔100 pL,37℃作用1 h。 4.8洗板 按4.3操作。 4.9加酶底物溶液 每孔加10o pL,37℃作用20 min。 4.10终止反应 取出反应板,每孔加50 uL终止液终止反应。 4.11测吸光值 用酶标仪在490 nm波长下,以空白对照为参照,测定其吸光值(OD)。