YY/T 0127. 10-2001 口腔材料生物学评价 第2单元:口腔材料生物试验方法鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验(Ames试验)

YY/T 0127. 10-2001.Biological evaluation of dental materials-Part 2:Biological evaluation test method of dental materials-Salmonella typhimurium reverse mutation assay (Ames mutagenicity test). 5.3增菌培养 从冷冻贮存菌株管中刮取细菌置5 mL营养肉汤培养基中,经37C振荡(100次/min)培养10~12h,活菌数应达10°个/mL(或ODos≈0.4)。细菌培养液从37C取出后,应立即放人冰浴中备用。试验需用当天孵育好的新鲜细菌。 5.4菌株鉴定 5.4.1组氦酸需求(his- )试验 凡组氨酸营养缺陷型试验菌株只能在补充组氨酸的培养基上生长,而在缺乏组氨酸的培养基上不能生长。 鉴定方法:在底层培养基平m表面加入0.5 m mol/L L-组氨酸0.1 mL和0.5 m mol/L D-生物素0.1mL.用L.棒铺开。对照平皿只加生物素不加组氨酸。用白金耳浸细菌培养液,在对照平皿和含有组氨酸/生物素的平皿表面分别平行划线。四株细菌可划在同一个平皿上,经37C孵育24 h后,观察细菌生长情况。试验菌株在含组氨酸平皿上生长,在对照平皿上不应生长。 5.4.2脂多糖屏蹄缺陷鉴定(rfa突变) 粗糙型突变的微生物,其细胞表面一层脂多糖屏障已经破坏,因此一些大分子物质能穿过菌膜进人.菌体内而抑制其生长。野生型茵株或含gal缺失的菌株则不受影响。鉴定方法:分别将每种细菌培养液0.1 mL加到45C 2 mL顶层培养基试管内,混匀后倾倒于营养琼脂培养基平皿表面,使其均匀分布。待固化后,取直径为6mm无菌滤纸圆片浸1mg/mL结晶紫溶液10pL,放到平皿中央。经37C孵育24h后,围绕四纸片出现透明的抑菌环(直径大约14mm),说明此菌存在深粗型(rfa)突变。TA 97.TA 98.TA 100、TA 102均有抑菌环。野生型鼠伤寒杆菌无抑菌环。 5.4.3对紫外线敏感性鉴定(uvrB修复缺陷型的容定) 具有uvrB修复缺陷型的试验菌株,在紫外线照射后仍能照常生长,借此证明uvrB突变的存在。鉴定方法:用白金耳没细菌培养液,在营养琼脂培养基平皿表面平行划线,四株细菌可划在同一平皿上。用黑纸覆盖平皿一半,在距离33cm处用15 W紫外线杀菌灯照射平皿8s.经37C孵育24h后观察结果。对紫外线墩感的園株(TA 97.TA 98,TA 100)只在未照射过的一半平皿上生长。而具有uvrB .修复缺陷型的菌株(TA102)在紫外线照射(未盖黑纸的另一半平皿)后仍能生长。 5.4.4抗氨苄 青霜索(PKM101)试验(菌株R因子丢失鉴定) 含R因子的试验菌株对氨苄青霍索具有抗性。R因子不稳定容易丢失，从而使试验菌株丧失R因子的特性,故需鉴定R因子是否存在. 鉴定方法1:用白金耳没细菌培养液,在含氨苄青霉索平皿表面平行划线,四株细菌可划在同-平皿上。还应选用一个无抗性因子的蘭株。以测定氦苄青霉素的效应。经37C孵育24h后,无抗性因子菌株不应生长。 鉴定方法2:用白金耳没细菌培养液，在营养琼脂培养基平皿表面平行划线,四株细菌可划在同一平皿上。将沾有氦苄青霉素溶液的滤纸条与划线交叉故置,37C孵育24h.如滤纸条周围细菌生长正常。说明试验菌株具有R因子。 5.4.5四环索(PAQI)抗性的鉴定