YY/T 0606.25-2014 组织工程医疗产品 第25部分:动物源性生物材料DNA残留量测定法:荧光染色法

YY/T 0606.25-2014.Tissue engineered medical product-Part 25:Quantification of remnant DNA in biological materials utilizing animal tissues and their derivatives: Fluorescence method. 5.1 总则 实验方案的设计主要依据(中华人民共和国药典)2010年版.三部,附录IX-B外源性DNA残留量测定法及参考文献。 YY/T 0606.25所采用的实验方案包括三个步骤: a)动物源性生物 材料的消化处理,如:蛋白酶K消化(适用于固体或胶体状材料); b)消化后样品的DNA纯化(如:磁珠吸附法); c) 纯化后样品的DNA残留量测定(荧光染色法)。 试验样品除供试品之外,需同步设定回收率试验样品(可使用标准品LambdaDNA)。因动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分.其对荧光染色法DNA测定有较强的干扰作用,因此本试验方法设定对供试品DNA做进-步纯化以排除干扰,保证精密度和回收率试验均符合要求。每次测定均应从一开始的消化步骤起增加回收率实验,并用回收率力程对测定结果进行校正。 试验过程中应采取防止DNAase污染的措施,如:戴手套操作.使用没有DNAase污染的专用实验台和实验用具及仪器。 以下将以蛋白酶K消化、磁珠法DNA纯化PicoGreen荧光染色三步法为例叙述试验步骤。 5.2试验步骤 5.2.1消化处理 5.2.1.1供试品及 反应液的准备 每份样品设三个平行样。取供试品精确称重并记录.放进1.5 mL DNase free无菌离心管内。 注1;干燥型样品:取供试品精确称重并记录.放进1.5 mL DNase free无菌离心管内,用无菌眼科剪将样晶剪成适当大小,加DEPC水至预先设定的体职,于4 C冰箱内放置12 h~24 h,使样品充分水和、软化。 注2:湿润型样品:取供试晶,放进1.5 mL DNase free无菌离心管内。13 000 r/min离心10 min,去除液体分。另取与上述同样大小的样品,陈干或真空干燥后精确称重并记录,用于样品干重单位重量内DNA残留量的计算. 注3:胶体型样品:称取供试品.放于1.5 mL DNase- free无菌离心管内,如果后续的DNA纯化时裂解液的加能够使胶体型样品分解,则可省略蛋白酶K消化步骤,直接进行下一步实验。 注4:骨质类样品:对于诸如同种异体骨等骨植人物样品应参照GA/T 383- 2002 的要求对供试晶进行脱钙理。待脱钙完全,组织变软后再进行蛋白房K消化处理。 注5:测试样品不限于上述种类。液态状样品不需要蛋白房K消化,可直接进行后续的DNA纯化试验。 注6:不含DNA分解酶(DNase fee):经过特殊处理,已证实不含DNA分解酶。本实验实施过程中所用的所有和样品直接接触的离心管.吸头、移液管等器材均需保证不含DNA分解酶,以便防止样本中残留DNA被分解而不能正确地检测到. 将上述供试品剪成尽量小的碎片后,加蛋白酶K缓冲液(10xProteinaseKbuffer)20pL,蛋白酶K (20 mg/ mL)10 L,加DEPC水至最终反应体积为210 pμL。 5.2.1.2回收率样 品及反应液的准备